분광 측색 비색계 정량법
단백질은 대개 단백질의 혼합물입니다. 비색 분석법은 단백질 구성 성분을 기반으로합니다 : 아미노산 (예 : 티로신, 세린)은 추가의 발색 기 또는 염료와 반응하여 착색 된 물질을 생성합니다. 착색 된 물질의 농도는 단백질이 반응하는 아미노산의 수와 직접적으로 관련되어 단백질 농도를 반영합니다.
비색법
BCA, Bradford, Lowry와 같은 여러 가지 방법이 있습니다.
Lowry 방법 : 가장 초기의 뷰렛 반응을 바탕으로 개선되었습니다. 단백질은 Cu2와 반응하여 청색 반응을 일으킨다. 그러나 Lowry 방법은 Biuret보다 더 민감합니다. 단점은 여러 가지 시약을 순차적으로 추가해야한다는 것입니다. 반응은 오랜 시간이 걸린다. 비 단백질 물질에 감염되기 쉽다. EDTA, 트리톤 x-100 및 암모니아 설페이트를 함유하는 단백질은이 방법에 적합하지 않다.
Bicinchoniinine 산성 분석 : 이것은 더 새롭고보다 민감한 단백질 분석입니다. 분석 할 단백질은 알칼리성 용액에서 Cu2와 반응하여 Cu를 생성하며, 이는 BCA와 킬레이트를 형성하여 562 nm에서 흡수 피크를 갖는 보라색 화합물을 형성합니다. 이 화합물과 단백질의 농도 사이의 선형 관계는 강하고, 반응 후에 형성된 화합물은 매우 안정하다. Lowry 방법과 비교하여 조작이 간단하고 민감도가 높습니다. 그러나 Lowry 방법과 마찬가지로 단백질 및 세제와의 간섭을 받기 쉽습니다.
브래드 포드 방법 :이 방법의 원리는 단백질이 쿠마시 브릴리언트 블루와 반응하여 595 nm에서 흡수되는 착색 된 화합물을 생성한다는 것입니다. 가장 큰 특징은 Lowry와 BCA의 감도의 2 배입니다. 그것은 더 간단하고 빠릅니다. 한 종류의 반응 시약 만 있으면됩니다. 화합물은 결과를 촉진시키기 위해 1 시간 동안 안정 할 수있다; Lowry와 간섭하여 BCA는 환원제 (예 : DTT, 머 캅토 에탄올)와 반응합니다. 그러나 세제에는 여전히 민감합니다. 주된 단점은 서로 다른 표준이 같은 표본의 결과에 큰 차이를 가져올 수 있고 비교 가능한 결과가 없다는 것입니다.
첫 번째로 비색계 측정에 노출 된 일부 연구자는 다양한 비색계 테스트의 결과에 혼동을 줄 수 있습니다. 어떤 방법으로 혼란 스럽다고 생각하십니까? 그룹이 다른 방식으로 반응하고 색좌표가 동일하지 않기 때문에 동일한 샘플의 샘플 농도가 일치하지 않게하기 위해 여러 가지 방법이 동시에 사용됩니다. 예를 들어, Keller et al. 인간의 우유에서 단백질을 검사 한 결과, Lowry와 BCA에 의해 측정 된 농도가 Bradford의 것보다 유의하게 높다는 것을 발견했다. 그 차이는 상당했다. 동일한 표본이 결정 되더라도 같은 표색계 방법으로 선택된 표준 표본은 일치하지 않으며 시험 후 농도도 일관성이 없습니다. 예를 들어, Lowry를 사용하여 BSA를 표준으로 사용하고 1.34 mg / ml의 농도로, 그리고 글로불린을 2.64 mg / ml의 농도로 사용하여 세포 균질 액에서 단백질을 테스트합니다. 그러므로 비색법을 선택하기 전에 시험 할 시료의 화학적 조성을 참고하여 화학적으로 유사한 표준 단백질을 표준으로 찾는 것이 바람직합니다. 또한, 단백질을 정량하는 비색법은 종종 시료의 흡광도 값이 너무 낮아서 측정 된 시료 농도와 실제 농도 사이에 큰 차이를 가져 오는 문제를 야기합니다. 핵심 쟁점은 1011 분광 광도계의 중요한 부분 인 큐벳의 색이 특정 반감기를 가지므로 각 비색법이 반응 테스트 시간을 나열한다는 것입니다. 모든 샘플 (표준 샘플 포함)은이 시간 내에 테스트해야합니다. 시간이 너무 길면 얻어진 흡광도 값이 작아지고 환산 된 농도 값이 감소합니다. 또한, 반응 온도, 용액의 pH 값 등은 모두 실험에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 또한, 플라스틱 측색법을 사용하는 것이 매우 중요합니다. 반응 후 색상이 석영이나 유리가 착색되어 시료의 흡광도가 부정확해질 수 있으므로 석영 또는 유리로 만든 큐벳을 사용하지 마십시오.
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