분광 광도계는 현대 분자 생물학 실험실에서 일상적인 도구가되었습니다. 종종 핵산, 단백질 정량 및 박테리아 성장 농도의 정량화에 사용됩니다.
분광 광도계의 간단한 원리
분광 광도계는 여러 파장을 생성 할 수있는 광원을 사용하고 일련의 분광 장치를 통과하여 특정 파장의 광원을 생성합니다. 광원이 피검 시료를 통과 한 후에 광원의 일부가 흡수되고 시료의 흡광도가 계산되어 시료 농도로 변환됩니다. . 시료의 흡광도는 시료의 농도에 비례합니다.
핵산의 정량화
핵산의 정량화는 분광 광도계에서 가장 자주 사용되는 기능입니다. 올리고 뉴클레오티드, 단일 가닥, 이중 가닥 DNA 및 RNA는 완충액에서 정량화 할 수 있습니다. 핵산의 최고 흡수 피크의 흡수 피크는 260 nm이다. 각 핵산의 분자 구성이 다르므로 전환율이 다릅니다. 다른 유형의 핵산을 정량화하려면 사전에 해당 계수를 선택하십시오. 예를 들어, 1 OD의 흡광도는 dsDNA 50 μg / ml, ssDNA 37 μg / ml, RNA 40 μg / ml 및 Olig 30 μg / ml에 해당합니다. 시험 후의 흡광도를 상기 계수로 환산하여 대응하는 시료 농도를 구한다. 테스트하기 전에 올바른 절차를 선택하고 원액과 희석제의 부피를 입력 한 다음 공시 료 및 샘플 용액을 테스트합니다. 그러나 실험이 항상 원활하지는 않았습니다. 불안정한 수치가 실험자에게 가장 큰 골칫거리가 될 수 있습니다. 높은 감도를 갖는 기기는 흡광도에서 더 큰 표류를 보입니다.
실제로, 분광 광도계의 설계 원리와 작동 원리는 흡광도가 특정 범위 내에서 변할 수있게합니다. 즉, 계측기는 특정 정확도와 정밀도를 갖습니다. 예를 들어, Eppendorf Biophotometer의 정확도는 ≤1.0 % (1A)입니다. 이러한 다중 검사의 결과는 평균의 약 1.0 %에서 다르며 정상입니다. 또한, 핵산 자체의 물리 화학적 성질 및 핵산이 용해되는 완충액의 pH, 이온 농도 등도 고려할 필요가있다. 시험 중 이온 농도가 너무 높으면, 독서 교대, 그래서 특정 pH 값과 낮은 이온 농도를 사용하는 것이 좋습니다. TE와 같은 버퍼는 판독 값을 크게 안정화시킵니다. 샘플의 희석 농도도 무시할 수없는 요소입니다 : 샘플에서 일부 미립자, 특히 핵산 샘플의 필연적 인 존재로 인해. 이러한 작은 입자들의 존재는 테스트 결과를 방해합니다. 시험 결과에 대한 입자의 효과를 최소화하기 위해, 핵산의 흡광도는 적어도 0.1A 이상인 것이 요구되고, 흡광도는 0.1 내지 1.5A 인 것이 바람직하다.이 범위 내에서, 입자가 비교적 작고 그 결과가 안정하다.
이것은 시료의 농도가 너무 낮거나 너무 높아서는 안된다는 것을 의미합니다 (광도계의 시험 범위를 벗어남). 마지막으로, 혼합과 같은 작동 인자가 충분해야합니다. 그렇지 않으면 흡광도 값이 너무 낮아서 음의 값이됩니다. 혼합물은 거품이 존재할 수 없으며, 공 액체는 현탁 물질을 가지고 있지 않다. 그렇지 않으면 독서가 급격히 바뀐다. 동일한 큐벳을 사용하여 블랭크 및 샘플을 테스트해야합니다. 그렇지 않으면 농도의 차이가 너무 큽니다. 변환 계수 및 시료 농도 단위가 일관되게 선택됩니다. 창문이있는 큐벳은 사용할 수 없습니다. 샘플의 부피는 큐벳에 필요한 최소 부피에 도달해야합니다.
핵산 농도 이외에 분광 광도계는 샘플의 순도를 나타내는 몇 가지 매우 중요한 비율, 예를 들어 A 260 / A 280의 비율과 같이 단백질의 흡수 피크가 280 nm. 1.8 (DNA) 또는 2.0 (RNA)보다 큰 비율의 순수한 시료. 이 비율이 1.8 또는 2.0보다 낮 으면 단백질 또는 페놀 물질의 존재를 나타냅니다. A 230은 탄수화물, 펩타이드, 페놀 등과 같은 일부 오염원이 샘플에 존재하고 순수한 핵산 A 260 / A 230의 비율이 2.0 이상임을 나타냅니다. A (320)는 용액의 탁도 및 다른 간섭 인자를 검출한다. 순수 샘플의 경우 A 320은 일반적으로 0입니다.
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